Иммерсия
Все объективы разделяются на сухие и иммерсионные, или погружные. Сухим называется такой объектив, между фронтальной линзой которого и рассматриваемым препаратом находится воздух. При этом ввиду разницы показателя преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя. Объективы сухой системы имеют обычно большое фокусное расстояние и дают малое (10×) или среднее (40×) увеличение.
Иммерсионными, или погружными, называют такие объективы, между фронтальной линзой которых и препаратом помещается жидкая среда с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. В качестве иммерсионной среды используют обычно кедровое масло. Можно использовать также воду, глицерин, прозрачные масла, монобромнафталин и др. При этом между фронтальной линзой объектива и препаратом устанавливается однородная (гомогенная) среда (стекло препарата – масло – стекло объ- ектива) с одинаковым показателем преломления. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, создавая условия наилучшего освещения препарата. Величина (n) показателя преломления равна для воды 1,33, для кедрового масла 1,515, для монобромнафталина 1,6.
Техника микроскопирования
Микроскоп при помощи кабеля питания подключают к электрической сети. С помощью револьвера устанавливают в ход лучей объектив с увеличением ×10. Легкий упор и звук щелчка пружины револьвера свидетельствуют о том, что объектив установлен по оптической оси. Ручкой грубой фокусировки опускают объектив на расстояние 0,5 – 1,0 см от предметного столика.
Правила работы с сухими объективами.
Приготовленный препарат помещают на предметный столик и закрепляют зажимом. С помощью сухого объектива с увеличением ×10 просматривают несколько полей зрения. Передвигают предметный столик боковыми винтами. Нужный для исследования участок препарата устанавливают в центре поля зрения. Поднимают тубус и вращением револьвера переводят объектив с увеличением ×40, наблюдая сбоку, макрометрическим винтом снова опускают тубус с объективом почти до соприкосновения с препаратом. Смотрят в окуляр, очень медленно поднимают тубус до появления контуров изображения. Точную фокусировку производят с помощью микрометрического винта, вращая его в ту или другую сторону, но не более чем на один полный оборот. Если при вращении микрометрического винта чувствуется сопротивление, значит, ход его пройден до конца. В этом случае поворачивают винт на один-два полных оборота в обратную сторону, снова находят изображение при помощи макрометрического винта и переходят к работе с микрометрическим винтом.
Полезно приучить себя при микроскопировании держать оба глаза открытыми и пользоваться ими попеременно, так как при этом меньше утомляется зрение.
При смене объективов не следует забывать, что разрешающая способность микроскопа зависит от соотношения апертуры объектива и конденсора. Числовая апертура объектива с увеличением ×40 составляет 0,65, неиммергированного конденсора – 0,95. Привести их в соответствие практически можно следующим приемом: сфокусировав препарат с объективом, следует вынуть окуляр и, глядя в тубус, прикрывать ирисовую диафрагму конденсора до тех пор, пока ее края не станут видны у границы равномерно освещенной задней линзы объектива. В этот момент числовые апертуры конденсора и объектива будут примерно равны.
Источник
Порядок проведения микроскопического исследования
Современные микроскопы являются сложными техническими устройствами, чувствительными к настройке и правилам эксплуатации. Перед началом работы они должны быть настроены и адаптированы под зрение микроскописта. Это лучше поручить инженерной службе, но можно провести самостоятельно, используя рекомендации по настройке и эксплуатации микроскопа (Приложением №3 настоящей инструкции). Несоблюдение правил настройки может привести к существенному снижению эффективности микроскопических исследований.
Исследование мазков, окрашенных по методу Ziehl-Neelsen, производится в проходящем свете с помощью светового микроскопа. Исследование рекомендуется производить с помощью бинокулярного микроскопа или монокулярного микроскопа, оснащенного бинокулярной насадкой.
При исследовании мазков, окрашенных флуоресцентными красителями, используется люминесцентный микроскоп. При этом одной из важных особенностей работы с мазками, окрашенными флюорохромами, является то, что они не подлежат длительному наблюдению в выбранном поле зрения, так как интенсивность люминесценции окрашенного объекта быстро снижается. Другой особенностью работы является необходимость строгого соблюдения режима работы люминесцентного микроскопа:
Ртутную лампу нельзя выключать ранее, чем через 15 минут после ее зажигания. Повторное включение ртутной лампы допускается только через 10 минут после ее выключения (полного ее охлаждения).
Для предохранения препаратов от выцветания в перерывах между наблюдениями необходимо закрывать лампу шторкой.
Перед началом микроскопического исследования необходимо: проверить наличие на столе для микроскопии необходимого для проведения микроскопического исследования оборудования и дополнительных материалов; снять чехол, которым накрыт микроскоп;
осмотреть микроскоп и протереть сухой салфеткой
механические части микроскопа;
убедиться в целости оптической системы;
включить осветительную систему и убедиться в достаточности
с помощью бумажной салфетки или марлевого тампона,
смоченного спирто-эфирной смесью, протереть линзы
убедиться в том, что подготовленные для микроскопии
окрашенные препараты достаточно хорошо высушены;
с помощью вращения винта грубой фокусировки (макровинта)
опустить предметный столик, максимально отдалив его от
поворотом револьверного устройства установить объектив с
малым увеличением (10х) точно над конденсором;
поместить на столик предметное стекло так, чтобы мазок
находился прямо под объективом (при этом обязательно
убедится, что мазок находится в верхней плоскости
предметного стекла, а не снизу);
закрепить препарат на столике с помощью клемм или
с помощью винтов препаратоводителя выбрать участок мазка
раздвинуть окуляры до полного совмещения изображений,
видимых правым и левым глазом исследователя;
глядя сбоку, внимательно контролировать расстояние между
стеклом и линзой объектива. Медленно вращая винт грубой
фокусировки (макровинт), поднять предметный столик с
препаратом к объективу, но не допускать соприкосновения
предметного стекла с линзой объектива;
глядя через окуляр, отрегулировать интенсивность светового
потока так, чтобы свет был ярким, но комфортным. Для этого
используют регулятор накала лампы, темные или матовые
фильтры и лишь в крайнем случае изменяют степень открытия
диафрагмы. Положение конденсора не изменяют;
продолжая смотреть через окуляр, медленно повернуть
макровинт, чтобы предметный столик отошел от линзы
объектива. Обычно для получения изображения достаточно
несколько поворотов винта;
затем, гладя в окуляр, медленно вращать микровинт до тех
пор, пока не появится изображение мазка. Небольшими
поворотами микровинта настроить изображение до получения
достаточной резкости. Никогда не поднимайте столик
микроскопа, глядя в окуляр. Это может привести к
соприкосновению фронтальной линзы объектива с
предметным стеклом, повреждению линзы или порче
глядя правым глазом в правый окуляр, сфокусировать изображение;
глядя левым глазом в левый объектив, сфокусировать
изображение путем поворота дополнительного
фокусировочного кольца, расположенного на левом окуляре.
Для исследования объекта с большим увеличением с помощью
«сухой» оптической системы, глядя на препарат сбоку, выбрать
объектив с более сильным увеличением. Убедиться, что этот объектив
не касается предметного стекла, и поворотом револьверного
устройства переместить выбранный объектив, установив его
непосредственно над препаратом. При этом мазок должен оставаться
С помощью микровинта сфокусировать резкость изображения. Правильная настройка света также может улучшить качество изображения.
Все манипуляции по настройке проводятся при сфокусированном на объект микроскопе. При настройке объект должен быть выведен из поля зрения, иными словами, после получения резкого изображения объекта предметное стекло смещается таким образом, чтобы поле зрения под объективом было прозрачным.
Работа с объективом масляной иммерсии. Порядок работы:
— добиться четкого изображения объекта в поле зрения с помощью
сухого объектива малого увеличения и определить наиболее
подходящий для исследования участок препарата;
— поворотом револьверного устройства сместить сухой объектив
так, чтобы стал свободным доступ к препарату;
— нанести на выбранный участок препарата одну каплю
иммерсионного масла. Капля должна свободно упасть на стекло (при
этом желательно немного смазать иммерсионным маслом
фронтальную линзу объектива). Пипетка капельницы масла ни в коем
случае не должна соприкоснуться с мазком. Это может привести к
переносу микобактерий с одного мазка на другой, к загрязнению
иммерсионного масла и получению ложноположительного результата
микроскопического исследования;
— поворотом головки револьверного устройства установить
объектив с сильным увеличением (90х — ЮОх) непосредственно над
препаратом.
— глядя сбоку, под контролем глаза медленно вращать макровинт
грубой фокусировки и поднимать столик микроскопа до появления
мениска в момент соприкосновения фронтальной линзы объектива с
поверхностью капли масла.
— глядя в окуляр, с помощью винтов грубой и тонкой регулировки
произвести настройку на резкость. Во время выполнения этой
манипуляции будьте особенно внимательны и смещайте винты на
небольшой ход, не допуская бесконтрольно полного оборота винтов.
В случае появления в поле зрения пузырьков воздуха операцию настройки (момент соприкосновения фронтальной линзы объектива с
иммерсией) необходимо повторить, предварительно удалив масло с объектива.
При микроскопическом исследовании мазка, окрашенного по Ziehl-Neelsen, следует просматривать не менее 100 полей зрения, чтобы дать количественную оценку препарату и обнаружить единичные микобактерии. В том случае, если результат такого исследования оказывается отрицательным, для подтверждения просматривают дополнительно 200 полей зрения.
При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерии достаточно исследовать 20 — 50 полей зрения как при окраске по Ziehl-Neelsen, так и при люминесцентной микроскопии (см. Таблицу 2).
При микроскопическом исследовании препарата необходимо быть уверенным, что ни одно поле зрения препарата не просматривается повторно, поэтому рекомендуется просматривать препарат всегда по одной и той же схеме:
— либо 3 параллельных прохода по длине препарата,
— либо 9 параллельных проходов по ширине.
Просматривать препарат начинают с левого верхнего выбранного
в мазке поля зрения, постепенно передвигаясь либо вдоль продольной оси препарата до конца мазка, либо смещаясь вниз и затем вновь поднимаясь вверх и т.д., проходя все поля зрения до границы мазка.
При увеличении микроскопа ЮООх, т.е. ЮОх для масляно-иммерсионного объектива и 10х для окуляра, при исследовании одной длины мазка (
20 мм) за один продольный проход просматривается около 100 — 120 полей зрения (диаметр поля зрения — 0,16 — 0,2 мм).
При люминесцентной микроскопии с использованием объектива 25х и окуляра 10х площадь поля зрения примерно в 10 раз больше, поэтому можно просматривать меньшее число полей зрения. Однако при отрицательном результате или малом количестве выявляемых микобактерии следует просматривать не менее 100 полей зрения.
По окончании микроскопического исследования каждого препарата следует:
освободить препарат от механических держателей — клемм
снять препарат с предметного столика микроскопа;
сверить идентификационный номер и записать результат
микроскопии на специальном листе бумаги, на котором перед
началом микроскопии написать в столбик порядковые номера
препаратов, подлежащих исследованию;
затем, удерживая препарат за ребра стекла в участке, где
нанесен порядковый номер, положить препарат на покрытый
фильтровальной бумагой поднос (лоток) в вытяжной шкаф;
для удаления иммерсионного масла накрыть препарат
полоской фильтровальной бумаги;
смочить ее несколькими каплями ксилола или толуола;
через 2 — 3 минуты фильтровальную бумагу удалить;
очищенный от иммерсионного масла препарат поместить в
коробку для просмотренных стекол.
При большом количестве исследуемых препаратов рекомендуется заранее подготовить 2 выстланных фильтровальной бумагой подноса (лотка) — для положительных и отрицательных препаратов — и удаление иммерсионного масла производить по окончании микроскопического исследования одновременно со всех просмотренных препаратов или части их.
В зависимости от результатов микроскопического исследования просмотренный препарат поместить в коробку для положительных или для отрицательных препаратов.
Перед тем, как взять для исследования следующий препарат, необходимо протереть иммерсионную линзу кусочком специальной ткани или марлевым тампоном.
По окончании микроскопического исследования всей партии мазков выполнить следующие процедуры:
с помощью бумажной или марлевой салфетки протереть
линзы микроскопа спирто-эфирной смесью или спиртом;
опустить предметный столик микроскопа, отдалив его от
уменьшить интенсивность освещения и выключить источник
накрыть микроскоп полиэтиленовым или пластиковым
расставить все необходимое для микроскопии оборудование и
дополнительные материалы в установленном порядке;
снять и удалить одноразовые перчатки;
перенести результаты микроскопического исследования в
лабораторный регистрационный журнал и на бланки ответов.
Источник